Высоцкий монастырь был основан в 1374 году, как уже говорилось, князем Владимиром Андреевичем Храбрым. Будучи духовным чадом преподобного Сергия Радонежского, Владимир Андреевич, решив построить в своем городе монастырь, поехал к преподобному Сергию с просьбой прибыть в Серпухов для совета и благословения на это дело. Преподобный Сергий откликнулся на просьбу князя и, несмотря свои преклонные годы и зиму, пешком, в сопровождении своего ученика Афанасия, пришел из своего монастыря в Серпухов. Осмотрев местность, преподобный Сергий указал место для будущей обители - на берегу реки Нары, почти на месте впадения ее в Оку, на холме, носившем название "Высокое".
Руководство монастырем Сергий поручил своему ученику Афанасию, получившему прозвище Старшего. После того, как он вместе с митрополитом Киприаном отбыл в 1387 году в Константинополь, где и остался до конца своих дней, его преемником по управлению обителью стал его же ученик преподобный Афанасий Высоцкий (Младший), управлявший монастырем недолго - девять лет. Тогда же, в XIV столетии в монастыре подвизался преемник преподобного Сергия преподобный Никон Радонежский, здесь он был пострижен в монахи и получил священный сан. В монастыре начинал свой монашеский путь и преподобный Пафнутий, основатель Боровского монастыря. В Высоцкой обители обучался иконописи преподобный Андрей Рублев, написавший несколько икон для обители.
Князь Владимир Серпуховской активно помогал обители строиться и благоустраиваться. Он выстроил в любимом им монастыре каменный собор и теплую церковь с трапезой. В 1380 году в обители в братской могиле были погребены воины Серпуховского ополчения, павшие на Куликовом поле.
Серпухов являлся городом, который, среди других порубежный городов, держал южную оборонительную границу Московского княжества - реку Оку. Именно через Серпухов нередко на Москву шли татары и поэтому под городом часто проводили смотры войск, на которые прибывали из Москвы великие князья и цари, останавливавшиеся в монастыре и жертвовавшие деньги на его содержание. Монастырь терпел невзгоды вместе с городом - так, в 1571 году он был разграблен и сожжен Девлет Гиреем, был сильно разорен в годы Смуты. С появлением на престоле царя Михаила Федоровича Романова (1613-1645) Михаил Романов и его преемник на царском престоле Алексей Михайлович (1645-1676) постоянно посещают монастырь и поддерживают его богатыми вкладами. В 70-е годы XVII столетия вокруг обители были воздвигнуты каменные стены с четырьмя угловыми башнями вместо старой деревянной ограды.
До середины XVIII века монастырь процветал: он имел до 70 человек монахов, огромную библиотеку, большую ризницу, на территории монастыря было семь действующих церквей и собор. В январе 1734 года в монастыре был погребен канцлер граф Гавриил Иванович Головкин (1660-1734), родственник царицы Наталии Кирилловны, матери императора Петра I. После того, как по указу Екатерины II у монастырей были отняты земли и они стали существовать только на положенное по штату государственное содержание и на пожертвования верующих, положение ухудшилось. Но все равно в начале XX века Высоцкий монастырь считался одним из самых благоустроенных во всей России.
В 20-х годах XX столетия для монастыря наступили черные дни. Соседний женский монастырь был превращен в военное училище, и престарелые монахини были переведены в Высоцкий монастырь, где были размещены в настоятельском корпусе и в подсобных помещениях. Монахам же Высоцкого монастыря было предложено покинуть обитель и после их ухода братский корпус заняли латышские стрелки. Однако богослужения в обители совершались до 1931 года, пока не арестовали настоятеля архимандрита Пантелеймона. После ареста настоятеля монахини разошлись кто куда, и монастырь прекратил свое существование и был превращен в тюрьму, где не раз производились массовые расстрелы. В послевоенные годы помещения монастыря использовались под жилье и складские помещения. В это время было разрушено три башни и большая часть стен. Монастырский комплекс разрушался, и в нем были начаты реставрационные работы, которые шли очень медленно. В 1991 году монастырь начал возрождаться.
Самым первым храмом монастыря была Зачатьевская церковь, заложенная преподобными Сергием и князем Владимиром Андреевичем, которая стояла на месте нынешнего Никольского храма. Возвратившись с Куликова поля, князь решил отметить победу строительством нового обширного храма в обители и над братской могилой убитых в Куликовской битве воинов он выстроил храм во имя Зачатия Пресвятой Богородицы праведной Анной, который в перестроенном виде сохранился до нашего времени. Тогда же, в 1380 году, был заложен и другой храм - во имя Покрова Богоматери. В 1381 на освящение обоих храмов прибыл преподобный Сергий Радонежский. От подлинного Покровского храма до наших дней сохранился только белокаменный подвал под восточной частью существующего храма.
После пожара и разрушения в 1571 году возникла необходимость в реконструкции пострадавших строений обители. В это время возводится из кирпича и новое здание трапезной с Покровской церковью на высоком подклете, в котором расположились житница, теплый погреб, хлебня и кузница. С Зачатьевским собором трапезную соединяла тогда же выстроенная галерея. В таком виде храм просуществовал около столетия. В конце XVII столетия Покровский храм вновь подвергся коренной перестройке. С южной стороны Покровского храма располагались палаты, в которых останавливались все великие князья и цари вплоть до царя Алексея Михайловича. Поскольку в Зачатьевском соборе службы совершались лишь в летнее время, Покровский храм служил зимним храмом обители.
С южной стороны Зачатьевского собора, на месте, где при основании обители была воздвигнута первая деревянная церковь, находится храм, посвященный Преподобному Сергию. В нынешнем виде храм существует с конца XVI века. С северной стороны Зачатьевского собора, в самом конце галереи находится маленький придельный храм Рождества Богородицы. Храм этот, неизвестно когда и кем устроенный, существовал уже в конце XVI века.
Современная трехъярусная колокольня была сооружена около 1840 года взамен старой, которая пришла в ветхость и рухнула, к счастью, никого не задев. Во втором ярусе колокольни был устроен храм во имя Трех Великих святителей - Василия Великого, Григория Богослова и Иоанна Златоуста. Трехсвятительский храм был первым храмом, в котором начались ежедневные богослужения в 1991 году во вновь открытой обители. На колокольне до закрытия монастыря в 1931 году было 14 колоколов, самый большой весил 721 пуд, и башенные часы с циферблатами на четыре стороны. Все колокола были сняты, и только в 1995 году удалось вернуть пять из них. Установили и новые часы с перезвоном.
В Высоцком монастыре был еще один храм - церковь во имя преподобных Афанасия Афонского и Сергия Радонежского. Он находился между Зачатьевским собором и Покровским храмом над местом погребения преподобного Афанасия Высоцкого (Младшего). Первый храм на этом месте вместо часовни был построен в 1697 году на средства бояр Нарышкиных. К сожалению, во время реставрации монастыря в 1967 году этот замечательный храм был разрушен до основания, "как не имеющий исторической и художественной ценности". В настоящее время на месте храма выстроено крытое крыльцо в русском стиле с маковкой и крестом. До закрытия монастыря в 1931 году здесь была богатейшая ризница, содержавшая драгоценные произведения искусства. После закрытия монастыря почти вся ризница была спрятана монахами и до настоящего времени не найдена.
Монастырь в наши дни широко известен своей чудотворной иконой Божией Матери "Неупиваемая Чаша", по молитвам к которому происходят исцеления от алкоголизма, наркомании и курения. О многочисленных чудесах красноречиво свидетельствуют сотни золотых колец, повешенных у иконы в благодарность за чудо, специальная книга с описаниями случаев исцелений от иконы, множество писем, приходящих в монастырь ежедневно.
В Покровском храме находятся мощи преподобного Афанасия Высоцкого (Младшего), второго игумена монастыря. В монастыре также собрано более 200 частиц мощей различных святых от первых веков христианства до новомучеников.